-پردازش ساختار بافتHISTOLOGICAL PROCESSING                               مورفولوژي كلي و تغييرات فوق ساختاري در برون كاشتي ها يا اسفنج هاي كشت شده PHEMA را ميتوان توسط ميكروسكوپ چشمي و ميكروسكوپ انتقال الكترون (TEM) بر بافت پردازش شده در صمغ اپوكسي مشاهده كرد. كاشتني هاي خارج شده از بدن بايد به مدت 48-24 ساعت در 5/2% گلوتارآلدهيد نگهداري شده و از قبل در 1% اسميوم تتراكسايد تثبيت شوند. نمونه ها توسط محلول هاي درجه بندي شده اتانول آب گيري شده و سپس در اكسيد پروپيلن غوطه ور مي شوند. سپس نمونه به وسيله صمغ اپوكسي و تعويض روزانه صمغ قديم با صمغ تازه به مدت 72 ساعت پالايش مي شوند. قسمت هاي نيمه نازك (2) براي ميكروسكوپ چشمي و قسمت هاي فوق نازك (nm1/0) براي TEM توسط يك فراميكروتوم (فراريزبر) با تيغه الماس بريده مي شوند. لكه هاي بررسي شده براي آزمايش نور شامل هماتوكسيلين و ائوسين، قرمز اليزارين (روناس)، سه رنگ طبيعي (تري كروم) ميسون و آبي تلوئيدين مي شود. به غير از لكه آبي تلوئيدين، بخش هاي ديگر بايد با غوطه ور شدن  به مدت 2 دقيقه در اتوكسيد سديم وهيدراته شدن از طريق محلول هاي درجه بندي شده اتانول پلاستيكه شوند.

تجمع تحريك آميز سلول را در اسفنج هاي برون كاشتني PHEMA را مي توان توسط تمركز ايمني شيميايي ياخته هاي ماكروفاژ با استفاده از به كارگيري پادتن ها بر ماكروفاژهاي بخش هاي منجمد شده و پارافيني بافت تثبيت شده در 2% پارافرم آلدئيد شناسائي كرد. نوتروفيلها را مي توان با اعمال ‎آنزيم شيمي بافت بر بخش هاي منجمد تثبيت شده در سيتوات – استون فرم آلدئيد نگهداري شده در كلرواستات AS-D نفتال در PH 3/6 به مدت 15 دقيقه در تاريكي و دماي C0 37 شناسائي كرده و توسط هماتوكسيلين با لكه ها مقابله كرد. عبارت ماهيچه صاف  اكتين به عنوان علامت شيميايي تبديل مايوفيبربلاست به كار رفته و توسط روش هاي متمركز سازي ايمني ياخته شيميايي در كشت سلولي قابل شناسائي است.

محصول ماتريس برون سلولي در برون كاشتني ها PHEMA توسط اتوراديو گرافي شناسائي مي شوند. كلاژن توليد شده توسط سلول ها ونوع آن را مي توان با استفاده از پرولين  H ]3 –3 و 2[- (مقدماتي) و تمركز ايمني ياخته شيميايي انواع كلاژن I- VI با پادتن هاي انساني و كلاژن گاوي شناسائي كرد. اين موضوع نشان مي دهد كه اسفنج هاي PHEMA هم نفوذ و هم ته نشيني سلول را ميسر ساخته و يك داربست بافت سه بعدي پايدار و اشكل مي دهد.

چگالي و زيست پذيري سلول را ميتوان با استفاده از تصحيح روش لك اندازي فلورسانت كه توسط پول و همكارانش صورت گرفت انجام داد. اين روش بسيار حساس و قابل اطمينان از دو نوع رنگ فلورسانت استفاده مي‌كند: 5-كلرومتيل فلورسئين دي استيت (CMFDA) و اتيديم و هموديمر (هم پار) 1 كه به ترتيب جهت شناسايي سلول هاي زنده و مرده مورد استفاده قرار مي گيرد. نمونه هاي بافتي برون كاشته شده با اهداف متفاوت همراه با CMFDA و يا با اتيديم هموديمر 1 به مدت 24 ساعت در C0 37 نگهداري مي شوند. بعد از آن گونه ها به طور مختصر در 2% پارافرمالدهايد تثبيت شده و در دماي بهينه برش محيط پيرامون منجمد (OCT) مي شوند. بخش هاي منجمد شده را مي توان بر روي اسلايدهاي پوشيده شده با آمينو پروپيل تري تكسي سيلان جمع آوري كرده و در ميكروسوپ فلورسانت مشاهده نمود و بدين ترتيب تحليل نيمه كمي از سلول هاي زنده و مرده به عمل آورد.

-اشارات و فوت و فن هاTIPS AND KNOW – HOW

نرخ منومر در آب تنها فاكتور مهم در كنترل مورفولوژي نهايي است . متغيرهاي ديگري كه مي توانند بر مورفولوژي نهايي تأثير بگذارند شامل دماي زمان بسپارش، مقدار اكسيژن حل شده در تركيب منومر و غلظت و نوع مواد شيمايي در تركيب منومر است.

تثبيت اين پارامترها در زمان بررسي اثر تغيير يكي از آنها بسيار مهم است.

HEMA بايد يك سيال صاف بوده و اگر هر گونه زردي در آن مشاهده شود بايد منومر خارج گردد. HEMA معمولاً قبل از استفاده تحت خلاء تقطير مي شود و در صورتي كه باز دارنده ها (ممانعت كننده ها) و هيدروكوئينين مونومتيل اتر (MEHQ) را از آن خارج كنيم زمان ذخيره سازي (نگهداري) آن كوتاه مي شود. اگر HEMA با خلوص بالا حاوي كمتر از ppm50 ، MEHQ خريداري شود و بطري آن به طور مرتب تعويض شودHEMA  را مي توان بسادگي پس از دريافت استفاده كرد. بهتر است كه منبع ويژه HEMA را انتخاب كرده و مقادير كمي از آن به عنوان توزيع كننده، نگهداري شود و هر 6 ماه يك بار يك بطري جديد سفارش داده شود.

معمولاً مقداري اتيلن دي متا اكريليت ‍(EDMA) در HEMA خريداري شده وجود دارد كه براي بررسي حساسيت با تخريب پذيري مي توان EDMA  را به وسيله استخراج در هگزان خارج كرد. براي استفاده عمومي، نيازي به خارج سازي EDMA از HEMA نبوده و براي ايجاد همخواني (سازگاري) بين دسته ها توصيه مي شود كه HEMA را توسط غلظت مشخصي از EDMA خنثي كرد. اين كار از واكنش كنتيك متغيرها جلوگيري كرده و خطاهاي ناشي از رهايش مقادير كم EDMA به تركيب منومر را برطرف مي‌كند. عامل شبكه ساز با اثر گذاري بر كنتيك هاي واكنش مصرف HEMA و همچنين كنتيك هاي تفكيك فاز در برابر ژل شدگي نقش پيچيده اي را در آرايش داربست بازي مي‌كند. برخلاف ژل هاي PHEMA ارتباط زيادي بين غلظت عامل شبكه ساز و استحكام داربست هاي PHEMA وجود ندارد غلظت معمول به كار رفته EDMA براي داربست ها در حدود  %wt25/0 1/0 است.

محلول تازه پرسولفات آمونيوم (APS) بايد براي هر فرمولاسيون تهيه شده و ساده ترين روش براي اين فرايند تكراري سنجش دقيق g(*) 1/0 و پوشاندن ظرف با آب تا g(*)1 است. وزن ظرف بايد در تعادل وزني بين APS اضافي و آب محاسبه شود. اسفنج هاي PHEMA ساخته شده با غلظت هاي كم APS معمولاً ضعيف و چسبنده هستند. در صورتي كه تمايل به واكنش آرام داشته باشيم به جاي بازدارنده مي توانيم از عامل شتاب دهنده با غلظت ضعيف تر استفاده كنيم.به طور كلي غلظت APS بايد بيشتر از wt%3/0 غلطت منومر باشد. براي غلظت هاي پائين تر منومر ممكن است نياز به غلظت بالاتر باشد. براي مثال براي يك تركيب 10:90، HEMA و آب، غلظت wt%5/0 توصيه مي شود. TEMED به محض دريافت با توزيع در تركيب منومر توسط ميكروپيپت استفاده مي شود. TEMED يك اهدا كننده الكترون بسيار قدرتمند تر از ديگر عامل هاي شتاب دهنده (تسريع كننده) مانند متابي سولفات سديم (SMBS) و اسيد اسكوربيك بوده و در نتيجه نرخ واكنش آن بسيار سريع تر است. هنگامي كه عامل شتاب دهنده SMBS باشد لايه لايه شدگي و استقرار ورفولوژي مشاهده مي شود.

براي خارج كردن اكسيژن حل شده مي توان گاز نيتروژن يا هليوم را براي مدت زمان مشخصي (~15 دقيقه) به شكل حباب در تركيب منومر وا رد كرده و يا اينكه ميتوان منو ر را به صورت عرضه شده (تحت پردازش قرار نگرفته) مصرف كرد. اسفنج PHEMAرا كه با گاز خنثي حباب دار شده اند را با آنهايي كه نشده اند مقايسه نكنيد. خروج اكسيژن حل شده بر نرخ واكنش و در نتيجه مورفولوژي تأثير مي گذارد. در صورت استفاده از منومر عرضه شده انسجام (هم خواني) هر تركيب ضروري است.

-نتايج و خط مشي آيندهCONCLUSIONS AND FUTURE DIRECTIONS   تهيه داربست نفوذ پذير سلولي PHEMA ساخته شده توسط بسپارش HEMA در آب اضافي و اتوكلاوكردن آنها راحت بوده و گران نمي باشد. علاوه بر اين طرح شيمي ارائه شده در اين فصل اجازه ساخت مكرر داربست هاي PHEMA را مي دهد. داربست هاي PHEMA در آب فرسوده نشده و توليد محصولات تخريبي نمي كند و حد فاصل سلول- سطح داربست پايدار است. اصلاح سطح مانند افزودن پپتيد يا مولكول هاي زيست فعال تترينگ به اين دار بست مصنوعي امكان پذير بوده و از عملكرد هيدروكسيل بهره مي برد.

اسفنج هاي PHEMA را ميتوان با مقادير بسيار كم عامل شبكه ساز (wt%05/0~) ساخته و هر گونه ناخالصي EDMA قابل حذف كردن است. در صورتي كه داربست هاي PHEMA جهت تخريب اصلاح شوند، آزمايشات ارزيابي تورم كاشتني و محصولات سمي و تخريب پذير لازم خواهد بود.

تشكيل داربست توسط بسپارش نسبت به روش هاي ديگر تهيه داربست داراي مزايايي است. داربست در حين بسپارش از نواحي عاري از پليمر و غني از پليمر تشكيل شده و بدين ترتيب شكل و مورفولوژي  را مي توان بالقوه توسط تحريكات خارجي از قبيل نيروهاي سانتريفوژ يا نور تغيير داد. چنين كنترلي بر شكل داربست، مي تواند منجر به چندگاني مورفولوژي ها و هندسه آنها شده كه براي كاربردهاي مهندسي بافت مطلوب است.